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一聽(tīng)到高端的光學(xué)顯微鏡，你是不是會(huì)立刻想到徠卡、蔡司、奧林巴斯這些國(guó)外品牌？現(xiàn)在，我國(guó)也具備了高端超分辨光學(xué)顯微鏡的研制能力。

據(jù)“科學(xué)大院”公眾號(hào)（kexuedayuan）12月29日消息，中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所（簡(jiǎn)稱(chēng)“蘇州醫(yī)工所”）已經(jīng)研制出了激光掃描共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、受激發(fā)射損耗(STED)超分辨顯微鏡、雙光子-STED顯微鏡等高端光學(xué)顯微鏡。

12月26日，由蘇州醫(yī)工所承擔(dān)的國(guó)家重大科研裝備研制項(xiàng)目“超分辨顯微光學(xué)核心部件及系統(tǒng)研制”通過(guò)驗(yàn)收，標(biāo)志著我國(guó)具備了高端超分辨光學(xué)顯微鏡的研制能力。

科研人員正在用自主研制的激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖片來(lái)源：中科院攝影聯(lián)盟、蘇州醫(yī)工所）

探索微觀世界 離不開(kāi)高端顯微鏡

高端顯微系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等相關(guān)前沿領(lǐng)域的創(chuàng)新研究，尤其是10-100nm尺度的超分辨顯微光學(xué)成像技術(shù)，在當(dāng)今生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，發(fā)揮著不可替代的作用。

作為生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的必備工具，激光掃描共聚焦顯微鏡比傳統(tǒng)的熒光顯微鏡分辨率更高，而且可以進(jìn)行層析掃描3D成像。但是共聚焦顯微鏡能夠觀察的樣品厚度一般小于100um，要觀察更深的樣品時(shí)需要借助雙光子顯微鏡。雙光子顯微鏡最大的優(yōu)勢(shì)是觀察的深度。

但是無(wú)論是激光掃描共聚焦顯微鏡還是雙光子顯微鏡，都無(wú)法擺脫衍射極限的限制，為了進(jìn)一步探索微觀世界，需要分辨率更高的顯微鏡。STED顯微鏡應(yīng)運(yùn)而生，它在共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上引入損耗光束將熒光光斑進(jìn)一步壓縮，從而實(shí)現(xiàn)超分辨成像。

數(shù)值孔徑為1.45的平場(chǎng)復(fù)消色差顯微物鏡（圖片來(lái)源：中科院攝影聯(lián)盟、蘇州醫(yī)工所）

我們都知道，美國(guó)和日本都是諾貝爾獎(jiǎng)大國(guó)，日本從2000年開(kāi)始基本每年一個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)，其中的原因之一就是離不開(kāi)顯微鏡等高端儀器的使用。我國(guó)雖然是顯微鏡消費(fèi)大國(guó)，但自己只能生產(chǎn)中低端產(chǎn)品，高端儀器基本依賴(lài)于進(jìn)口，這已經(jīng)嚴(yán)重制約了我國(guó)生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等相關(guān)前沿領(lǐng)域的創(chuàng)新研究。 

四臺(tái)高端顯微鏡 Made in China！

歷時(shí)五年攻關(guān)，蘇州醫(yī)工所科研人員全面突破大數(shù)值孔徑物鏡、特種光源、新型納米熒光增強(qiáng)試劑、系統(tǒng)集成與檢測(cè)等關(guān)鍵技術(shù)，研制出四臺(tái)高端顯微鏡，為我國(guó)高端光學(xué)顯微鏡的發(fā)展提供了系統(tǒng)解決方案。

高端平場(chǎng)復(fù)消色差生物顯微物鏡（圖片來(lái)源：中科院攝影聯(lián)盟、蘇州醫(yī)工所）

下面我們就來(lái)看看這四大國(guó)貨神器吧！

1. 激光掃描共聚焦顯微鏡

傳統(tǒng)熒光顯微鏡是用光源照射整個(gè)樣品平面，再獲得圖像。由于聚焦平面上下的平面也會(huì)受到激發(fā)產(chǎn)生熒光，圖像會(huì)被干擾；同時(shí)，同一平面上特征點(diǎn)周?chē)ぐl(fā)的熒光也會(huì)干擾特征點(diǎn)的觀察。

激光掃描共聚焦顯微鏡采用聚焦后的激光光斑作為照明光源，同時(shí)在探測(cè)器前引入針孔將聚焦光斑外的干擾信號(hào)進(jìn)行過(guò)濾，因此提高了圖像信噪比，橫向分辨率可達(dá)200nm左右。此外，激光共聚焦顯微鏡還可以對(duì)樣品逐層掃描實(shí)現(xiàn)三維成像，以及利用多通道采集圖像的功能同時(shí)獲取不同光譜段的熒光掃描圖像。

激光掃描共聚焦顯微鏡與普通熒光顯微鏡成像對(duì)比（圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)）

蘇州醫(yī)工所研制的激光掃描共聚焦顯微鏡樣機(jī)（圖片來(lái)源：蘇州醫(yī)工所）

激光共聚焦顯微鏡可以觀察細(xì)胞或亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子，如：檢測(cè)蛋白質(zhì)抗體及其他分子，檢測(cè)細(xì)胞凋亡，觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)等；還能進(jìn)行活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)檢測(cè)。

目前，利用蘇州醫(yī)工所研制的高端光學(xué)顯微鏡，中科院動(dòng)物所觀察發(fā)育生物學(xué)中的基本現(xiàn)象，研究潛在調(diào)控機(jī)制；中科院藥物所觀察藥物胞內(nèi)靶向定位和輸送，加速創(chuàng)新性新藥研發(fā)。

納米藥物在Caco-2細(xì)胞亞細(xì)胞器分布共聚焦成像（圖片來(lái)源：中科院上海藥物所）

小鼠卵母細(xì)胞紡錘體共聚焦成像（圖片來(lái)源：中科院動(dòng)物所）

2.雙光子顯微鏡

雙光子顯微鏡結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的特點(diǎn)。

雙光子激發(fā)技術(shù)的基本原理就是用兩個(gè)波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光子去激發(fā)一個(gè)熒光分子。由于光波波長(zhǎng)較長(zhǎng)，可實(shí)現(xiàn)成像深度超過(guò)600微米。那么問(wèn)題來(lái)了，什么情況下可以用兩個(gè)光子激發(fā)一個(gè)光子，實(shí)現(xiàn)能量疊加呢？答案是：提高光子密度。

在進(jìn)行雙光子成像時(shí)，物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是最高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)附近很小的區(qū)域內(nèi)，鄰近區(qū)域不產(chǎn)生熒光，因此不需要針孔過(guò)濾信號(hào)，提高了信號(hào)收集效率。

單光子（共聚焦）激發(fā)與雙光子激發(fā)（圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)）

蘇州醫(yī)工所研制的雙光子樣機(jī)圖（圖片來(lái)源：蘇州醫(yī)工所）

目前雙光子成像在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用于深層組織成像以及活體成像等。美國(guó)斯坦福大學(xué)、日本東京大學(xué)、陸軍軍醫(yī)大學(xué)腦科學(xué)研究中心等專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室利用雙光子顯微成像技術(shù)進(jìn)行了信息識(shí)別、行為控制等腦科學(xué)核心問(wèn)題的研究以及動(dòng)物在體成像實(shí)驗(yàn)，獲得了高分辨實(shí)時(shí)神經(jīng)元活動(dòng)成像數(shù)據(jù)。

CLARITY處理的Thy1-YFP（H Line）小鼠大腦的熒光觀察（圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)）

（A）從大腦皮質(zhì)到海馬的3-D觀察圖像（B）大腦皮層Ⅴ層的錐體細(xì)胞的樹(shù)突圖像

3.受激發(fā)射損耗（STED）顯微鏡

傳統(tǒng)光學(xué)成像由于受到光學(xué)衍射極限的限制，分辨率很難突破200nm。這時(shí)就需要超分辨顯微鏡出手了。

光學(xué)衍射極限降低分辨能力（圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)）

STED顯微鏡是一種超分辨顯微鏡，它的原理可以簡(jiǎn)單理解為在共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上加入一束面包圈狀的光斑（我們稱(chēng)之為損耗光），通過(guò)受激輻射效應(yīng)減小有效熒光發(fā)光面積，將被激發(fā)的熒光物質(zhì)限制在衍射極限內(nèi)，從而突破光學(xué)衍射極限實(shí)現(xiàn)超分辨成像，目前能夠?qū)崿F(xiàn)50nm分辨率。

STED原理（圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)）

細(xì)胞骨架共聚焦與STED對(duì)比圖（圖片來(lái)源：蘇州醫(yī)工所）

蘇州醫(yī)工所研制的STED樣機(jī)圖（圖片來(lái)源：蘇州醫(yī)工所）

STED顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域與共聚焦顯微鏡相似，主要用于觀察亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，活細(xì)胞內(nèi)生物分子的實(shí)時(shí)成像和動(dòng)態(tài)跟蹤等。目前，蘇州醫(yī)工所正與中科院上海藥物所以及中科院北京動(dòng)物所開(kāi)展相關(guān)合作。

4.雙光子STED顯微鏡

雙光子STED顯微鏡將雙光子顯微鏡與STED顯微鏡合二為一，結(jié)合雙光子顯微鏡成像深度深以及STED顯微鏡分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)不同的成像需求選擇合適的成像方式。

蘇州醫(yī)工所研制的雙光子-STED顯微鏡（圖片來(lái)源：蘇州醫(yī)工所）

目前，蘇州醫(yī)工所已聯(lián)合吉林大學(xué)第一醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院以及蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院針對(duì)難治性癲癇、帕金森病及缺血性腦卒中疾病等進(jìn)行研究。

科研人員正在用自主研制的雙光子-STED顯微鏡觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖片來(lái)源：中科院攝影聯(lián)盟、蘇州醫(yī)工所）

小鼠腦切片雙光子成像（圖片來(lái)源：蘇州醫(yī)工所）

導(dǎo)師，咱們實(shí)驗(yàn)室也買(mǎi)一臺(tái)？

在高端顯微鏡的研制過(guò)程中，設(shè)計(jì)、加工、裝配、檢測(cè)等等，并無(wú)現(xiàn)成標(biāo)準(zhǔn)、經(jīng)驗(yàn)可循；關(guān)鍵光學(xué)器件的加工難度超乎想象。

這次通過(guò)項(xiàng)目驗(yàn)收的四套超分辨率顯微鏡，最高分辨率達(dá)到了50納米，而且各有特色。“在它們的背后，是已經(jīng)發(fā)展起來(lái)的顯微光學(xué)設(shè)計(jì)、加工、制造、裝配的完整技術(shù)和工程體系。”例如大數(shù)值孔徑顯微物鏡，不過(guò)兩個(gè)膠囊咖啡大小的物鏡，卻由十幾片直徑為1-30毫米的特種玻璃鏡片裝配而成，做出這樣一個(gè)鏡頭，需要解決一系列難題，更需要精密的檢測(cè)設(shè)備和嚴(yán)格的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

高精度顯微物鏡光學(xué)元件加工（圖片來(lái)源：中科院攝影聯(lián)盟、蘇州醫(yī)工所）

目前，蘇州醫(yī)工所研制的顯微鏡和關(guān)鍵部件已有部分成果實(shí)現(xiàn)銷(xiāo)售，例如：雙光子顯微鏡已銷(xiāo)往德國(guó)、以色列、美國(guó)等多家國(guó)外研究機(jī)構(gòu)。北京大學(xué)、中科院神經(jīng)科學(xué)研究所等國(guó)內(nèi)科研機(jī)構(gòu)也使用了該設(shè)備。具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的特種LED光源體系具備了國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，支撐了包括新一代投影、光醫(yī)療儀器以及遠(yuǎn)程照明等新興產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。共聚焦顯微鏡也已完成工程化，擬進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和銷(xiāo)售。

該項(xiàng)目的成功實(shí)施，極大改善了我國(guó)高端光學(xué)顯微鏡基本依賴(lài)進(jìn)口的狀況，對(duì)滿足我國(guó)生物醫(yī)學(xué)等前沿基礎(chǔ)研究的定制化需求、提升創(chuàng)新能力，以及推動(dòng)我國(guó)光學(xué)顯微鏡行業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)具有重要的戰(zhàn)略意義。

（作者單位：中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所）