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一、疫源地消毒

（一）適用范圍。

適用于出現(xiàn)猴痘病例后，對其可能污染的場所和物品進行的隨時消毒和終末消毒。

（二）消毒原則。

1.范圍和對象確定。

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，確定現(xiàn)場消毒的范圍和對象。對病例在住院、轉(zhuǎn)運期間可能污染的環(huán)境和物品，進行隨時消毒。對病例居住或活動過的場所，如居住場所、工作場所、學(xué)習(xí)場所、診療場所、轉(zhuǎn)運工具，及其他可能受到污染的場所，在其離開后（如住院、轉(zhuǎn)院、出院、死亡）進行終末消毒。

2.方法選擇。

（1）診療用品消毒。盡量選擇一次性診療用品，非一次性診療用品應(yīng)首選壓力蒸汽滅菌，不耐熱物品可選擇化學(xué)消毒劑或低溫滅菌設(shè)備進行消毒或滅菌。

（2）手消毒。建議使用手消毒劑揉搓雙手進行消毒，也可選擇75%乙醇、過氧化氫等消毒劑。

（3）環(huán)境和物體表面消毒?？蛇x擇含氯消毒劑、二氧化氯、過氧乙酸、過氧化氫等消毒劑擦拭、噴灑或浸泡消毒。

（4）衣物、床單等紡織品消毒?？蛇x擇熱力消毒、含氯消毒劑或季銨鹽類消毒劑浸泡等消毒方式。

（三）常見污染對象的消毒方法。

1.手消毒。

可選用速干手消毒劑，或直接選用75%乙醇進行擦拭消毒；醇類過敏者，可選擇季銨鹽類等有效的非醇類手消毒劑。有肉眼可見污染物時，應(yīng)先使用洗手液（或肥皂）在流動水下按照六步洗手法清洗雙手，然后按上述方法消毒。

2.皮膚、黏膜。

皮膚被污染物污染時，應(yīng)立即清除污染物，再用一次性吸水材料沾取0.5%碘伏或過氧化氫消毒劑擦拭消毒3分鐘以上，使用清水清洗干凈；粘膜應(yīng)用大量生理鹽水沖洗或0.05%碘伏沖洗消毒。

3.床單、毛巾、衣服等紡織品。

病例使用的床單、毛巾、衣服等紡織品，無肉眼可見污染物時，若需重復(fù)使用，可用流通蒸汽或煮沸消毒30分鐘；或用有效氯500mg/L的含氯消毒劑或1000mg/L的季銨鹽類消毒劑浸泡30分鐘后，按照常規(guī)清洗；或用其他有效的消毒方法。不耐濕的衣物可選用環(huán)氧乙烷或干熱方法進行消毒處理。

有分泌物、滲出液、排泄物、血液、體液等污染物時，建議按醫(yī)療廢物集中處理。

4.餐（飲）具。

病例所使用的碗、盤、筷、杯等餐（飲）具清除食物殘渣后，煮沸消毒30分鐘，或使用有效氯500mg/L的含氯消毒劑浸泡30分鐘后，再用清水洗凈。

5.污染物。

對病例分泌物、滲出液、排泄物、血液、體液等少量污染物可用一次性吸水材料（如紗布、抹布等）沾取有效氯5000-10000mg/L的含氯消毒劑（或能達到高水平消毒的消毒濕巾/干巾）小心移除。

對病例分泌物、滲出液、排泄物、血液、體液等大量污染物應(yīng)使用含吸水成分的消毒粉或漂白粉完全覆蓋，或用一次性吸水材料完全覆蓋后用足量的有效氯5000-10000mg/L的含氯消毒劑澆在吸水材料上，作用30分鐘以上（或能達到高水平消毒的消毒干巾），小心清除干凈。清除過程中避免接觸污染物，清理的污染物按醫(yī)療廢物集中處置。

病例的分泌物等應(yīng)有專門容器收集，用有效氯20000mg/L的含氯消毒劑，按物、藥比例1:2浸泡消毒2小時。

清除污染物后，應(yīng)對污染的環(huán)境和物體表面進行消毒。盛放污染物的容器可用有效氯5000mg/L的含氯消毒劑溶液浸泡消毒30分鐘，然后清洗干凈。

6.地面、墻壁。

有肉眼可見污染物時，應(yīng)先完全清除污染物再消毒。無肉眼可見污染物時，可用有效氯1000mg/L的含氯消毒劑或500mg/L的二氧化氯消毒劑擦拭或噴灑消毒；不耐腐蝕的地面和墻壁，也可用2000mg/L的季銨鹽類消毒劑噴灑或擦拭；消毒作用時間不少于30分鐘。

7.物體表面。

診療設(shè)施設(shè)備表面以及床圍欄、床頭柜、家具、門把手、衛(wèi)生潔具和家居用品等有肉眼可見污染物時，應(yīng)先完全清除污染物再消毒。無肉眼可見污染物時，用有效氯1000mg/L的含氯消毒劑或500mg/L的二氧化氯消毒劑，不耐腐蝕的物體表面也可用2000mg/L的季銨鹽類消毒劑進行噴灑、擦拭或浸泡消毒，作用30分鐘后清水擦拭干凈。

8.污水和糞便。

在進入市政排水管網(wǎng)前需進行消毒處理，消毒后污水應(yīng)當(dāng)符合《醫(yī)療機構(gòu)水污染物排放標準》（GB18466-2005）。

9.病例生活垃圾。

病例生活垃圾按醫(yī)療廢物處理。

10.醫(yī)療廢物。

醫(yī)療廢物的處置應(yīng)遵循《醫(yī)療廢物管理條例》和《醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法》的要求，規(guī)范使用雙層黃色醫(yī)療廢物收集袋封裝后，按常規(guī)流程進行處置。

11.室內(nèi)空氣。

如經(jīng)科學(xué)評估，需對室內(nèi)空氣進行消毒，則在無人情況下，可選擇5000mg/L過氧乙酸、3%過氧化氫、二氧化氯（濃度按產(chǎn)品說明書）等消毒劑，按20mL/m3用超低容量（氣溶膠）噴霧法進行消毒。也可采用經(jīng)驗證安全有效的其他消毒方法。

二、注意事項

現(xiàn)場消毒應(yīng)確保所用消毒產(chǎn)品合法有效，所選消毒方法科學(xué)可行。現(xiàn)場消毒時，根據(jù)現(xiàn)場情況和相關(guān)標準要求，選擇合格有效的個人防護裝備，在做好個人防護的前提下，嚴格按照工作方案實施消毒。

消毒實施單位應(yīng)具備現(xiàn)場消毒能力，操作人員應(yīng)經(jīng)過消毒專業(yè)培訓(xùn)，掌握消毒和個人防護基本知識，熟悉消毒器械的使用和消毒劑的配制等。

每次開展消毒工作時均應(yīng)做好消毒記錄，包括消毒對象、消毒面積（體積）、消毒劑濃度（或消毒器械強度）、劑量、作用時間等。同時，相關(guān)部門和單位應(yīng)做好消毒工作的監(jiān)督管理和評價。

附件6

猴痘個人防護指南

為加強公眾、疫情處置相關(guān)工作人員和醫(yī)務(wù)人員的個人防護，避免猴痘病毒暴露感染，制定本指南。

一、居家隔離治療的病例等相關(guān)人員

（一）適用范圍。

適用于居家隔離治療的病例（疑似病例和確診病例）、照護人員或共同居住者的個人防護。

（二）居家隔離區(qū)域要求。

1.應(yīng)選擇有自然通風(fēng)、獨立衛(wèi)生間的房間作為隔離區(qū)域。

2.應(yīng)配備專用的餐具，床單、毛巾等床上用品，消毒劑和口罩等個人防護用品，電視和平板電腦等電子設(shè)備。

3.衛(wèi)生間宜配備專用的洗衣機，地漏應(yīng)有水封。

（三）病例管理要求。

1.應(yīng)能夠進行自我照護。

2.應(yīng)每天做好體溫測量和癥狀監(jiān)測，避免與他人共用個人物品。

3.避免與他人發(fā)生性接觸，避免與免疫力低下人員、兒童、老人、孕婦及其他人員的直接接觸，避免與寵物等動物接觸，避免捐獻血液等。

4.外出就診時，應(yīng)佩戴醫(yī)用外科口罩，著長衣長褲，確保遮住所有損傷皮膚，避免與他人密切接觸，避免乘坐公共交通工具。

（四）照護人員要求。

1.應(yīng)每天做好體溫測量和癥狀監(jiān)測。

2.應(yīng)盡量避免進入隔離區(qū)域。如需進入隔離區(qū)域，應(yīng)佩戴醫(yī)用外科口罩和一次性手套，與病例保持至少1米的距離。在離開隔離區(qū)域之后，應(yīng)加強手衛(wèi)生，并對脫下的口罩和手套進行消毒處理后廢棄。

3.在拿放和清洗居家隔離治療病例的床單、衣服和處理垃圾的過程中，應(yīng)避免抖動。用濕拖布拖地，避免干掃。用濕抹布清潔家居用品表面，地毯應(yīng)用蒸汽清洗，避免使用吸塵器。

4.應(yīng)將居家隔離治療病例的餐具、床單、毛巾和衣物單獨洗滌和消毒，可選擇熱力消毒、含氯消毒劑或季銨鹽類消毒劑浸泡等消毒方式。

（五）應(yīng)急處置。

1.照護人員或共同居住者出現(xiàn)任何癥狀或不適表現(xiàn)，應(yīng)當(dāng)及時前往指定醫(yī)療機構(gòu)就診并主動報告可疑接觸史。

2.對其接觸的物品、活動的區(qū)域等結(jié)合風(fēng)險評估結(jié)果進行消毒處理。

二、疫情處置相關(guān)工作人員

（一）適用范圍。

適用于猴痘疫情期間流行病學(xué)調(diào)查、環(huán)境清潔消毒人員的個人防護。

（二）流行病學(xué)調(diào)查人員防護要求。

1.個人防護裝備。一次性乳膠手套、醫(yī)用外科口罩、一次性隔離衣等。

2.個人防護要求。規(guī)范佩戴口罩，加強手衛(wèi)生，與被調(diào)查人員保持至少1米的距離。

3.廢物管理。調(diào)查結(jié)束后，廢棄的個人防護裝備暫存、處理和處置應(yīng)按照《醫(yī)療廢物管理條例》執(zhí)行。

4.應(yīng)急處置。如在調(diào)查過程中出現(xiàn)口罩脫落、直接接觸了病例皮膚或分泌物等情況，要結(jié)合被調(diào)查人員的臨床診斷結(jié)果、空間的密閉性、接觸的時間和距離等進行風(fēng)險評估，結(jié)合風(fēng)險評估結(jié)果，采取相應(yīng)的處置措施。

（三）環(huán)境清潔消毒人員防護要求。

1.個人防護裝備。一次性乳膠手套、醫(yī)用外科口罩、一次性隔離衣、防水靴套等。

2.個人防護要求。規(guī)范佩戴口罩，加強手衛(wèi)生，盡量減少與被消毒物品的直接接觸。

3.廢物管理。清潔消毒結(jié)束后，廢棄的個人防護裝備暫存、處理和處置應(yīng)按照《醫(yī)療廢物管理條例》執(zhí)行。

4.應(yīng)急處置。如在清潔消毒過程中出現(xiàn)口罩脫落、皮膚損傷或直接接觸排泄物、血液等情況，要結(jié)合被清潔消毒物品的類型、接觸的時間和空間的密閉性等進行風(fēng)險評估，結(jié)合風(fēng)險評估結(jié)果，采取相應(yīng)的處置措施。

三、醫(yī)務(wù)人員的個人防護

（一）適用范圍。

適用于猴痘疫情期間醫(yī)務(wù)人員及其工作環(huán)境的防護。

（二）基本要求。

1.個人防護裝備要求。醫(yī)務(wù)人員執(zhí)行標準預(yù)防，采取經(jīng)接觸傳播和經(jīng)飛沫傳播疾病的隔離與預(yù)防措施，佩戴一次性乳膠手套、KN95/N95及以上級別的口罩、防護面屏或護目鏡、一次性隔離衣等。

2.環(huán)境防護要求。醫(yī)院環(huán)境的清潔消毒應(yīng)符合附件5的要求。應(yīng)避免干除塵、清掃或吸塵等活動。首選濕式清潔方法。

3.廢物管理。個人防護裝備、病例敷料等暫存、處理和處置應(yīng)按照《醫(yī)療廢物管理條例》執(zhí)行。

附件7

猴痘病毒實驗室檢測技術(shù)指南

為指導(dǎo)各級疾控部門和其他相關(guān)機構(gòu)規(guī)范開展猴痘病毒實驗室檢測工作，快速、準確識別猴痘確診病例，制定本指南。本指南主要介紹標本采集以及猴痘病毒核酸熒光定量PCR檢測方法、生物安全要求等內(nèi)容。

一、檢測對象

（一）猴痘確診病例和疑似病例；

（二）密切接觸者；

（三）感染或疑似感染猴痘病毒的動物；

（四）環(huán)境或其它生物材料。

二、技術(shù)人員基本要求

（一）采樣人員。從事猴痘病毒核酸檢測標本采集的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)，培訓(xùn)合格后方可從事采樣工作。采樣人員應(yīng)熟悉采集標本種類和采集方法，熟練掌握標本采集操作流程及注意事項，做好標本信息記錄，確保標本質(zhì)量符合要求、標本及相關(guān)信息可追溯。

1.采樣人員個人防護裝備要求：KN95/N95及以上級別的口罩、防護面屏或護目鏡、一次性隔離衣、一次性乳膠手套（盡可能戴兩層）、靴套；如果接觸了病例血液、體液、分泌物或排泄物，應(yīng)及時更換手套。污水采樣人員可根據(jù)實際工作需要，適當(dāng)降低防護級別。

2.住院病例的標本由所在醫(yī)院醫(yī)護人員采集，根據(jù)實驗室檢測工作的需要，可結(jié)合病程多次采樣。

3.密切接觸者標本由當(dāng)?shù)丶部貦C構(gòu)或醫(yī)療機構(gòu)專業(yè)人員采集。

4.感染或疑似感染猴痘病毒的動物由當(dāng)?shù)丶部貦C構(gòu)協(xié)調(diào)動物疫控部門專業(yè)采樣人員負責(zé)采集。

5.環(huán)境或其它生物材料標本由相關(guān)專業(yè)采樣人員負責(zé)采集。

（二）檢測人員。實驗室檢測技術(shù)人員應(yīng)具備相關(guān)專業(yè)大專以上學(xué)歷或具有中級及以上專業(yè)技術(shù)資格，并有2年以上實驗室工作經(jīng)歷，接受過核酸檢測相關(guān)培訓(xùn)，培訓(xùn)合格后方可從事檢測工作。實驗室配備的工作人員數(shù)量應(yīng)與所開展檢測項目及標本量相適宜，確保能夠及時、熟練、準確地開展實驗室檢測和報告結(jié)果。

三、標本采集、保存和運輸

（一）標本采集種類。

1.首選標本是皮膚（黏膜）病變部位標本，包括病變表面拭子、痘皰液或痘皰滲出物拭子、痘痂或痘痂拭子等。

2.呼吸道標本，如口咽拭子，可用于病例急性期檢測，也是密切接觸者檢測最常用標本。

3.發(fā)病急性期可采集EDTA抗凝血標本進行核酸檢測。

4.采集發(fā)病后7天內(nèi)（急性期）、3-4周后（恢復(fù)期）雙份血清用于抗體檢測。

5.直腸拭子、尿液、精液、唾液等其它標本僅用于研究，根據(jù)工作需要采集。

6.污水或其它環(huán)境生物材料標本根據(jù)實際工作需要進行采集。

（二）標本采集要求。

采集皮膚（黏膜）病變部位標本時應(yīng)使用無菌聚酯纖維、尼龍或類似材質(zhì)拭子，避免使用棉拭子。采集疑似病例的標本前應(yīng)避免使用75%乙醇等消毒劑清潔病變部位。每種類型的皮膚（黏膜）病變應(yīng)盡可能采集兩個以上拭子，每個病例應(yīng)同時采集身體不同部位或外觀不同的2-3種病變標本。采集皮膚（黏膜）病變部位標本時應(yīng)適當(dāng)用力。皮膚（黏膜）病變部位、痘痂或分泌物等不同拭子標本應(yīng)放置于不同的采樣管中。進行病毒分離時應(yīng)采集干拭子標本（無采樣液）或以非滅活型病毒采樣液保存。根據(jù)實驗室活動資質(zhì)確定使用非滅活型或滅活型采樣液采集標本。

（三）標本采集方法。

1.斑疹、丘疹、水皰或膿皰等皮膚（黏膜）病變部位標本：一手緊握采樣拭子尾部，手與拭子頭部保持一寸以上距離。采樣時適當(dāng)用力下壓拭子，在皮損表面來回擦拭至少2-3次，然后以拭子另一面再重復(fù)擦拭2-3次。如果在擦拭過程中痘皰破裂，要確保采集到痘皰液。采樣后將拭子放置于無菌采樣管中（可含病毒采樣液或不含液體），折斷拭子頭，去除拭子尾部，蓋上管蓋，以消毒紙巾擦拭消毒采樣管，以封口膜密封管蓋后將采樣管保存或送檢。

2.痘痂或痘皰皮膚（黏膜）標本：采樣前應(yīng)確保實驗室可檢測此類標本。使用無菌鑷子或其他鈍頭器械夾取全部痘痂或面積至少4mm×4mm大小的痂皮，放置于干燥、無菌的采樣管中，采樣完成后以創(chuàng)可貼覆蓋患處。

3.口咽拭子標本：被采集人員頭部微仰，嘴張大，露出兩側(cè)扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側(cè)扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，將拭子頭浸入含2-3mL病毒保存液的管中或置于不含液體（干拭子）的無菌管中，尾部棄去，旋緊管蓋。

4.血液標本：盡量采集急性期（發(fā)病7天內(nèi)）的血液標本，建議使用含EDTA抗凝劑的真空采血管采集5mL全血，可利用全血進行檢測，或室溫靜置30分鐘后，1500-2000rpm離心10分鐘，收集血漿于無菌管中進行檢測。

5.血清標本：用真空負壓采血管采集血液標本5mL，室溫靜置30分鐘，1500-2000rpm離心10分鐘，收集血清于無菌螺口塑料管中。第一份血清應(yīng)盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）釆集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3-4周采集，采集血液標本5mL后室溫靜置30分鐘，1500-2000rpm離心10分鐘，收集血清于無菌螺口塑料管中，用于猴痘抗體檢測。

6.其他標本：依據(jù)設(shè)計需求規(guī)范采集。

（四）標本保存。

標本應(yīng)在收集后1小時內(nèi)冷藏（2-8℃）或冷凍（-20℃或以下），并盡快進行檢測。可在1周內(nèi)檢測的標本可置于4℃環(huán)境中保存；1周內(nèi)無法檢測的標本，短期可置于-20℃環(huán)境中保存，長期應(yīng)置于-70℃或以下環(huán)境中保存。全血分離血漿前冷藏（2-8℃），分離出的血漿置于-20℃或以下環(huán)境中保存。應(yīng)設(shè)立專庫或?qū)９駟为毐４鏄吮?，避免反?fù)凍融標本。

猴痘病毒及其相關(guān)標本應(yīng)由專人管理，準確記錄病毒及標本的來源、編號、數(shù)量等信息，具體要求可參考《病原微生物菌（毒）種保藏數(shù)據(jù)描述通則》（T/CPMA 011-2020）。應(yīng)采取有效措施確保病毒及標本安全，嚴防發(fā)生誤用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。

（五）標本送檢。

標本采集后應(yīng)盡快在低溫條件下（冰袋或干冰）送往實驗室，如需長途運輸標本，應(yīng)采用干冰冷凍運輸方式進行保藏。

1.送檢標本：病例標本先由省級及以下疾控機構(gòu)進行初步檢測，各省首例猴痘陽性標本應(yīng)送中國疾控中心病毒病所復(fù)核。每個陽性病例至少采集一套標本（皮膚或黏膜病變部位標本、口咽拭子標本及急性期、恢復(fù)期雙份血清標本）送中國疾控中心病毒病所檢測。各省級疾控機構(gòu)根據(jù)實際情況制定省內(nèi)樣本送檢、復(fù)核流程。

2.病原體及標本運輸：

（1）國內(nèi)運輸。猴痘病毒或其他潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬于A類，對應(yīng)的聯(lián)合國編號為UN2814，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術(shù)細則》的PI602分類包裝要求，通過其他交通工具運輸?shù)目蓞⒄找陨蠘藴拾b。猴痘病毒或其他潛在感染性材料運輸應(yīng)按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》（原衛(wèi)生部令第45號）辦理《準運證書》。污水等環(huán)境標本暫按普通生物樣本運輸標準執(zhí)行。

（2）國際運輸。猴痘毒株或樣本在國際間運輸?shù)?，?yīng)規(guī)范包裝，按照《出入境特殊物品衛(wèi)生檢疫管理規(guī)定》辦理相關(guān)手續(xù)，并滿足相關(guān)國家和國際相關(guān)要求。

四、猴痘病毒核酸檢測要求及流程

（一）實驗室資質(zhì)要求。

開展猴痘病毒核酸檢測的實驗室，應(yīng)當(dāng)符合《病原微生物實驗室生物安全管理條例》（國務(wù)院令第424號）或《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）有關(guān)規(guī)定，具備設(shè)區(qū)的市級衛(wèi)生健康部門備案的生物安全二級（BSL-2）實驗室及以上實驗室條件，并備案猴痘病毒相關(guān)實驗活動。獨立設(shè)置的醫(yī)學(xué)檢驗實驗室還應(yīng)符合《醫(yī)學(xué)檢驗實驗室基本標準（試行）》《醫(yī)學(xué)檢驗實驗室管理規(guī)范（試行）》等要求。

開展猴痘病毒分離、培養(yǎng)、中和等涉及病毒擴增、使用等實驗操作的實驗室應(yīng)具備國家衛(wèi)生健康委批準的生物安全三級（BSL-3）實驗室及以上實驗室條件，且獲得猴痘病毒實驗活動批準。分離的猴痘病毒應(yīng)送國家病原微生物保藏中心/國家病原微生物資源庫病毒分庫保藏。

（二）實驗室生物安全要求。

根據(jù)2006年公布實施的《人間傳染的病原微生物名錄》（簡稱《名錄》），猴痘病毒生物危害分類為第一類，是一種高致病性病毒。按照《名錄》要求，猴痘病毒的分離、培養(yǎng)等涉及病毒擴增及使用的實驗操作需在BSL-3及以上實驗室的生物安全柜內(nèi)進行；非滅活采樣液采集的猴痘病例樣本的滅活在BSL-3實驗室進行；樣本滅活后猴痘病毒DNA提取、檢測可在BSL-2及以上實驗室或PCR檢測的專門區(qū)域或房間進行。如《名錄》更新，開展猴痘病毒操作的實驗室生物安全要求應(yīng)按最新《名錄》執(zhí)行。污水樣本的滅活參照普通生物樣本。

（三）實驗室分區(qū)要求。

原則上開展猴痘病毒核酸檢測的實驗室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增和產(chǎn)物分析區(qū)。三個區(qū)域在物理空間上應(yīng)完全相互獨立，空氣應(yīng)定向流通。各區(qū)功能分別是：

1.試劑儲存和準備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應(yīng)混合液的制備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。

2.標本制備區(qū)：轉(zhuǎn)運桶開啟、標本滅活，核酸提取及加入至擴增反應(yīng)管等。

3.擴增和產(chǎn)物分析區(qū)：核酸擴增和產(chǎn)物分析。

根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。如采用標本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，標本制備區(qū)、擴增和產(chǎn)物分析區(qū)可合并。

（四）主要儀器設(shè)備。

實驗室應(yīng)當(dāng)配備與開展檢驗項目相適宜的儀器設(shè)備，包括：二級生物安全柜、高速臺式離心機、干浴恒溫器、熒光定量PCR儀、計時器、移液器。

（五）實驗室猴痘病毒核酸檢測流程。

實驗室接到標本后，按照標準操作程序進行試劑準備、標本前處理、核酸提取、核酸擴增、結(jié)果分析及報告。實驗室應(yīng)當(dāng)建立可疑標本和陽性標本復(fù)檢流程。

1.試劑與材料。

（1）標本：包括病變表面拭子、痘皰液或痘皰滲出液拭子、痘痂或痘痂拭子、咽拭子、全血或血漿等標本。

（2）核酸提取試劑盒（基因組DNA提取試劑盒）：組織基因組DNA提取試劑盒或血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒。

（3）核酸檢測試劑：

①試劑：DNA聚合酶或預(yù)混的PCR反應(yīng)試劑（PCR Master Mix）。

②猴痘病毒檢測引物、探針:

③陽性對照：涵蓋檢測靶標序列的質(zhì)粒。

（4）滅菌去離子水、無水乙醇

（5）消毒液

①75%乙醇：用于手部和物體表面常規(guī)消毒，開啟后有效期為1周。

②含氯消毒液：現(xiàn)用現(xiàn)配，含有效氯1000mg/L的消毒液用于物體表面常規(guī)消毒，含有效氯5000mg/L的消毒液用于感染性材料溢灑時的應(yīng)急處理。

（6）耗材：包括帶濾芯的吸頭、螺旋口的離心管、非螺旋口的離心管、含鋯珠的粉碎管、PCR反應(yīng)板和透明封膜或PCR反應(yīng)管和透明蓋。

（7）BSL-2個人防護用品：包括KN95/N95口罩及以上級別的口罩、一次性隔離衣、防護眼罩或面屏、一次性帽子、鞋套、靴套和手套。

2.實驗前的標本接收。

（1）核對被檢標本編號、姓名、性別、年齡及檢測項目；

（2）待檢標本的狀態(tài)如有異常，需注明；

（3）待檢標本長期存放在-70℃，短期存放可在-20℃，避免反復(fù)凍融。

3.核酸檢測操作步驟及注意事項。

（1）病毒核酸（DNA）的制備

操作方法按DNA提取試劑盒相應(yīng)說明書進行操作，具體如下：

①提取試劑準備：第一次開啟試劑盒，在使用前先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積參照瓶上標簽。所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫；所有離心步驟應(yīng)在室溫下進行。

②處理樣本：

A.痘皰液：干拭子標本需以適當(dāng)體積的含PS的PBS或DMEM重懸后檢測。取100μL樣本，加入80μL緩沖液，總量為180μL；標本體積不足100μL時用緩沖液補足總體積至180μL；

B.病變皮疹或痘痂：取1塊痂皮按質(zhì)量/體積（1mg/50μL）加入相應(yīng)體積含PS的PBS，研磨或勻漿處理，取80μL，然后加入100μL緩沖液；

C.咽拭子、其它拭子：從采樣液中取200μL標本，干拭子標本可用3mL含PS的PBS或DMEM重懸，混勻后取200μL；

D.全血或血清：直接取200μL標本。

③加入20μL蛋白酶K溶液，混勻，溶液會變清亮。若樣本為病變皮疹或其它組織時，加入蛋白酶K混勻后，在56℃放置，直至組織溶解，再進行下一步驟。

④加入200μL裂解緩沖液，充分混勻，70℃放置10分鐘，或至溶液變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁水珠。

需注意：加入裂解緩沖液后可能會出現(xiàn)白色絮狀沉淀，在70℃放置后會消失。如溶液未變清亮，說明細胞裂解不徹底，可能導(dǎo)致提取DNA量少或提取出的DNA不純。

⑤加200μL無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁水珠。

⑥將上一步驟所得溶液和絮狀沉淀均加至吸附柱中（吸附柱放入廢液收集管中），8000rpm離心1分鐘，棄廢液。

⑦加入500μL漂洗緩沖液1（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），8000rpm離心1分鐘，棄廢液。

⑧加入500μL 漂洗緩沖液2（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），最大轉(zhuǎn)速13000rpm離心3min，棄廢液。

⑨將吸附柱放回廢液收集管中，最大轉(zhuǎn)速13000rpm離心1分鐘，盡量去除漂洗液。

⑩將吸附柱轉(zhuǎn)入一根干凈的離心管中(需自行準備，試劑盒中未提供)，加入50μL洗脫緩沖液或滅菌去離子水，室溫放置2-5分鐘，8000rpm離心1分鐘。收集濾出液，做好標記，4℃或-20℃（短期）保存?zhèn)溆茫?70℃長期保存。

（2）核酸檢測：實時熒光定量PCR（qPCR）方法檢測猴痘病毒核酸（PCR實驗室進行）。

①反應(yīng)體系的準備：每孔20μL，加入5μL樣本DNA，共計25μL；每次PCR反應(yīng)，除檢測標本外，應(yīng)加無DNA對照（用水代替DNA）、陽性對照；所有樣本，包括對照，應(yīng)設(shè)復(fù)孔。

②加樣: 每根反應(yīng)管中加入核酸或?qū)φ崭?uL，蓋緊管蓋或封好透明膜，置于熒光定量PCR檢測儀上。

③擴增條件設(shè)定：

④儀器檢測通道選擇:使用熒光定量PCR檢測儀，選擇Fam熒光信號檢測通道，收集設(shè)在60℃。具體設(shè)置方法參照各儀器使用說明書。

⑤結(jié)果分析閾值設(shè)定:使用熒光定量PCR檢測儀進行結(jié)果分析時，基線取3-10或6-15個循環(huán)的熒光信號，閾值設(shè)定原則為閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線最高點，也可根據(jù)儀器噪音情況調(diào)整閾值。

（3）核酸檢測結(jié)果判斷

①Real-time PCR反應(yīng)系統(tǒng)的質(zhì)量控制:反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時符合以下2個條件，否則試驗結(jié)果無效，應(yīng)重新開展檢測。陰性對照無擴增，為陰性。陽性對照未出現(xiàn)陰性結(jié)果。

②結(jié)果判定：

A.陰性：雙孔Ct值＞37，或無Ct值；

B.灰區(qū)：一孔Ct值＞37；

C.陽性：雙孔Ct值＜37。

所有陽性和處于灰區(qū)的標本應(yīng)重復(fù)檢測或經(jīng)序列分析進行確診。需注意：當(dāng)標本僅為咽拭子或血清、血漿，且檢測結(jié)果為陰性時，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀，慎重做出陰性診斷。

（4）表格記錄

做好熒光定量實時PCR方法檢測猴痘病毒核酸原始記錄。

五、猴痘病毒全基因組測序

1.測序標本選取原則。本土疫情中的首發(fā)或早期病例、與早期病例有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵病例、感染來源不明的本土病例、境外輸入病例陽性標本等。以上標本在核酸熒光定量PCR檢測Ct值≤32時進行測序（關(guān)鍵樣本除外）。

2.測序要求。以省為單位確定開展猴痘病毒全基因組測序的機構(gòu)。建議使用擴增子技術(shù)進行猴痘病毒全基因組測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控合格后方可用于后續(xù)生物信息分析。二代測序平臺覆蓋深度應(yīng)不低于10×，三代測序平臺覆蓋深度應(yīng)不低于50×，全基因組測序覆蓋度應(yīng)不低于98%。數(shù)據(jù)比對分析推薦參考猴痘基因組NC_063383.1。

各省應(yīng)建立本省輸入、本土病例猴痘病毒基因組數(shù)據(jù)庫，應(yīng)具備序列對比分析能力。具備測序條件的省份要在接收標本后48小時內(nèi)開展測序工作，關(guān)鍵樣本要求實驗室收到標本后1周內(nèi)提供測序結(jié)果報告，所有測序原始數(shù)據(jù)(一般為fastq格式)、組裝序列（一般為fasta格式）和標本序列測定結(jié)果報告單（見附件7-2）應(yīng)在獲得序列48小時內(nèi)報送中國疾控中心病毒病所進行序列匯總、分析。病毒病所應(yīng)將序列分析結(jié)果及時反饋各省，并將全國猴痘病毒序列匯總、分析結(jié)果及時上報國家疾控局。

3.分子分型。推薦使用在線分析工具Nextclade（https:// clades.nextstrain.org）對變異株進行分子分型。

附件：

7-1猴痘病毒檢測標本送檢表

7-2猴痘病毒標本序列測定結(jié)果報告單